Lo studio delle caratteristiche fotofisiche di singole molecole riveste un notevole interesse poiché possono essere studiati fenomeni non rivelabili studiando proprietà fotofisiche d’insieme su soluzioni comprendenti miliardi di molecole.
Grazie a nuove tecniche di immobilizzazione e di
microscopia è possibile oggi eseguire esperimenti di spettroscopia a
molecola singola a temperatura ambiente anche su proteine. Per le GFP, la metodologia più seguita prevede la loro immobilizzazione in gel biocompatibili di poli(acrilammide). In questo modo, la diffusione proteica è impedita e, ad elevate diluizioni, è possibile osservare la
fluorescenza di singole
proteine fino alla loro fotodegradazione (photobleaching).
Una delle prime caratteristiche peculiari di singola molecola è stata notata su una variante gialla della GFP (la S65G/S72A/T203F), e a essa fu dato il nome di blinking. Irradiando con un laser a 488 nm (corrispondente al massimo di assorbimento dello stato B di questa proteina) sono stati osservati
cicli alternati e ripetuti di emissione/non
emissione sino al raggiungimento del photobleaching dopo alcuni secondi. Questo comportamento è stato rivelato anche in altri omologhi della GFP, ed è stato mostrato che il tempo di fotoemissione attiva (ton) è inversamente proporzionale all’intensità di eccitazione mentre il tempo di non-emissione (toff) sembra esserne indipendente. L’origine di questo fenomeno è ancora in buona parte sconosciuta, sebbene vengano invocati processi di scambio protonico intra ed intermolecolari relativamente al cromoforo.
Sempre su una YFP è stato notato che la fotodegradazione non è irreversibile, dato che appare possibile recuperare fluorescenza irraggiando la proteina a 405 nm per alcuni minuti con intensità attorno a 1 W/cm2. Questo fenomeno di disattivazione/attivazione (on/off switching), distinto dal blinking perché il recupero dallo stato non fluorescente è indotto da irraggiamento, può essere ripetuto numerose volte su singole molecole. L’ on/off switching è stato dimostrato per altre varianti YFP35, alcune delle quali sviluppate nel laboratorio di tesi, e anche in proteine fluorescenti derivanti da alcuni celenterati. L’ipotesi meccanicistica più probabile considera il processo di fotospegnimento associato ad una transizione cis-trans del cromoforo mediante conversione interna a partire dallo stato eccitato A* . Nello stato fondamentale trans, il cromoforo si trova a più alta energia rispetto allo stato cis, dato che la maggior parte dei legami ad idrogeno con i residui circostanti sono persi. Anche l’assorbimento dello stato trans avviene ad energie più alte (360 nm) con resa di fluorescenza pressoché eguale a zero. Tuttavia, dallo stato trans eccitato è possibile, tramite un riarrangiamento strutturale o una conversione interna speculare a quella del fotospegnimento, riottenere lo stato fondamentale A e ripristinare l’emissione di fluorescenza. Evidenze recenti tendono ad integrare questa descrizione, suggerendo che lo stato fotoinattivo possa essere raggiunto anche a partire dallo stato B.
Si può osservare che il blinking è un effetto fotoindotto che conduce a uno stato non emissivo DSR che può portare a recupero spontaneo di fluorescenza in tempi piuttosto lunghi. L’ on/off switching, invece, è un fenomeno fotoindotto in entrambe le direzioni dove, dal corrispondente stato non emissivo DPR, si giunge a recupero di fluorescenza dopo irraggiamento ad una determinata lunghezza d’onda.
Con ogni probabilità, la fotodegradazione irreversibile è associata alla
formazione di uno stato di tripletto molto reattivo. Secondo l’ipotesi più plausibile, per queste proteine l’attivazione dello stato di tripletto conduce alla decarbossilazione della Glu222, con rilevanti cambiamenti del profilo di assorbimento ed eccitazione.
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