Lo spettro di assorbimento della GFP wild type (wt) mostra 3 bande molto intense. La prima presenta il suo
massimo a 278 nm, ed è imputabile alla presenza di residui amminoacidici contenenti gruppi laterali aromatici. Le altre due, con massimi a 398
nm e 475 nm, sono attribuibili a transizioni elettroniche del cromoforo. Nell’intervallo di pH in cui la proteina è stabile (pHstab= 4-11), le altezze relative di questi assorbimenti sono dipendenti dalla concentrazione protonica ed inversamente proporzionali tra loro. La banda a 398 nm ha il suo massimo a pH acidi, mentre quella a 475 nm lo possiede a pH intorno a 10.5-11. I due stati associati a questi assorbimenti sono denominati A e B, rispettivamente, e sono attribuibili a diverse forme di protonazione del cromoforo. Varie
analisi tra cui cristallografia, spettroscopia Raman e calcoli teorici indicano che il principale sito di protonazione-deprotonazione del
cromoforo è localizzato sull’O fenolico. Infatti gli altri due siti possibili, l’N imminico e l’O carbonilico, rimangono sempre deprotonati tra pH 4 ed 11. Pertanto, lo stato A è associato al fenolo (Tyr66) protonato (neutro), mentre B alla sua forma deprotonata.
Un’ulteriore differenza fondamentale tra gli stati A e B è evidenziabile a livello strutturale. Infatti, il residuo Thr203 forma un legame a idrogeno tra il proprio gruppo ossidrile e Tyr66 nella forma anionica; quando Tyr66 è in forma neutra, la treonina 203 è ruotata di 100° in direzione opposta al cromoforo7. Il passaggio tra l’una e l’altra conformazione sembra implicare un’energia piuttosto elevata, determinando un’interconversione lenta dal punto di vista cinetico. Eccitando lo stato A a 398 nm si ottiene
emissione di
fluorescenza con massimo a 508 nm ed una resa quantica pari a 0.79; eccitando lo stato B a 475 nm si ha una emissione di fluorescenza leggermente spostata verso il blu rispetto alla precedente, 503 nm, ma una resa quantica simile. L’analisi di fluorescenza temporalmente risolta ha mostrato come in entrambi i casi si abbia emissione a partire dallo stato eccitato di singoletto S1 del cromoforo in forma
anionica (B*), con un tempo di vita attorno a 3 ns. Tuttavia, mentre da B* si ottiene direttamente fluorescenza, lo stato di singoletto eccitato del cromoforo neutro (A*) subisce un processo di deprotonazione (t » 4 ps), con successiva emissione dalla forma anionica. Questo processo, denominato excited-state proton transfer (ESPT) è razionalizzabile con la tendenza delle specie fenoliche a diventare più acide nei loro stati eccitati. E’ stato inoltre notato che esiste un’emissione diretta dalla forma A* a 460 nm che, però, è sfavorita rispetto all’ESPT.
Mediante questo schema di emissione è possibile anche spiegare la leggera differenza dei picchi di fluorescenza tra A e B. Infatti, nonostante la specie emittente sia il cromoforo anionico in entrambi i casi, esso risente di un intorno diverso a seconda della specie eccitata a causa del lento riarrangiamento di Thr203 tra i due stati. Lo schema di emissione viene pertanto completato considerando le specie I ed I*, dove la struttura conformazionale della specie neutra coesiste con la natura anionica del cromoforo.
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