Mutazioni nella sequenza primaria della GFP nativa (wtGFP) che vadano ad interessare residui amminoacidici spazialmente vicini al
cromoforo o del cromoforo stesso modificano profondamente le caratteristiche di
assorbimento ed emissione della proteina. Con questo criterio, sono stati realizzati numerosi
mutanti della GFP che presentano caratteristiche fotofisiche molto diverse.
Nel 1998 fu suggerita una prima classificazione dei mutanti GFP in base alla lunghezza d’onda di emissione, ovvero al colore della loro fluorescenza. Le
proteine fluorescenti (FP) furono divise in quattro classi: blu (BFP), azzurre (CFP), verdi (GFP) e gialle (YFP). Ad oggi, si è aggiunta la classe delle proteine rosse (RFP), pur possedendo una bassa omologia strutturale a quella di wtGFP4.
I primi tentativi per la modifica delle proprietà spettrali delle FP hanno riguardato la
sostituzione della Tyr66 con altri aminoacidi aromatici: Phe, His e Trp. In tutti questi casi si ha una riduzione della estensione di coniugazione p, che è associata ad un effetto ipsocromo. Infatti, Y66F e Y66H GFP emettono nella ragione blu dello
spettro (450 nm, BFP), mentre Y66W GFP appartiene al gruppo delle CFP (480 nm). Per queste proteine, non vi è evidenza di processi ESPT e la
fluorescenza deriva direttamente dalla emissione dello stato A*.
Le GFP e YFP presentano sempre Tyr66, ma differiscono per la natura dei sostituenti attorno al cromoforo. Questi mutanti possono essere ulteriormente sottoclassificati in base allo stato più stabile prevalente del gruppo fenolico. Si hanno così le sottoclassi A e B, il cui nome denota lo stato di protonazione più stabile.
S65T è una GFP/B, ed è probabilmente la FP più utilizzata in campo biologico per la sua alta resa quantica e semplicità dello spettro di assorbimento che contiene, a pH fisiologico, solo la banda relativa a B 27. Apparentemente, la sostituzione di Ser65 con Thr rimuove un legame ad idrogeno con Glu222 in forma anionica, che a sua volta appare stabilizzare Tyr66 in forma neutra22. Viceversa, la sostituzione di Thr203 con residui apolari quali Val o Leu previene la stabilizzazione di Tyr66 in forma anionica e lo spettro di assorbimento di questi mutanti mostra prevalentemente la banda relativa ad A; T203V e T203I appartengono pertanto a GFP/A.
La sostituzione di Thr203 con un residuo aromatico (Tyr, Trp o Phe) induce un sensibile effetto batocromo sullo spettro di assorbimento e di emissione della GFP28. I mutanti così ottenuti appartengono alla classe delle YFP29. A loro volta, le YFP possono essere suddivise in YFP/A o YFP/B a seconda della protonazione prevalente di Tyr66 a pH fisiologico11. E’ bene osservare anche che, a differenza della wtGFP, la maggior parte delle GFP e YFP mostrano una notevole dipendenza dell’assorbimento e dell’eccitazione dal pH nell’intervallo fisiologico 5.0-8.0, dovuta sia allo stato di protonazione del cromoforo che a residui ionizzabili ad esso vicino.
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