Struttura tridimensionale
Dagli studi eseguiti con spettroscopia ai raggi X di cristalli singoli di GFP è stato notato
che questa proteina possiede una struttura tridimensionale molto particolare, che ricorda un cilindro cavo o un barilotto (in inglese, b-barrel), caratterizzato da un diametro di 24 Å ed una altezza di 42 Å . Le pareti del cilindro sono formate da 11 b-foglietti intrecciati a coppie e collegati tra loro mediante delle corte a-eliche che chiudono le due basi della struttura. All’interno di questa struttura estremamente stabile (Tstab 76 °C) è contenuta un’ulteriore a-elica che comprende il cromoforo della proteina11. Il cromoforo della GFP, il 4-(p-idrossibenzilidene) imidazolidin-5-one, ha struttura eterociclica molto coniugata, ed è generato da una modifica post-traduzionale della sequenza di 3 amminoacidi (Ser65-Tyr66-Gly67) durante il ripiegamento della proteina12. Come dimostrato dall’espressione del gene dell’ Aequorina GFP in altri organismi, la modifica post-traduzionale non necessita di specifici enzimi della medusa ma richiede ossigeno esogeno in assenza del quale non si sviluppa la
fluorescenza. Il meccanismo per la formazione del cromoforo procede in due stadi con cinetiche differenti. Inizialmente, si ha l’attacco nucleofilico dell’N ammidico della Gly67 sul C ammidico della Ser65 con formazione di un eteroanello imidazolinonico. In seguito, avviene l’
ossidazione del legame C-C coniugato all’anello fenolico della Tyr66 da parte dell’ossigeno molecolare ed il rilascio di una molecola di acqua, dando luogo all’estesa coniugazione π tra l’anello fenolico e l’imidazolinone. Sebbene il secondo processo possa avvenire sia con sequenza disidratazione-ossidazione sia ossidazione-disidratazione, recenti studi sembrano indicare che la disidratazione è successiva all’ossidazione. Complessivamente, questo secondo stadio costituisce la fase che determina la velocità di formazione del cromoforo, e si svolge con cinetiche temporali che vanno da qualche ora ad alcuni giorni. Come già ricordato, questa sequenza di reazioni è completamente spontanea a pH fisiologico ed in presenza di ossigeno, e non richiede nessun enzima o cofattore. Il corretto ripiegamento della proteina è necessario per ottenere un ambiente rigido e strutturato intorno al cromoforo, comprendente una rete di legami idrogeno coinvolgenti quattro molecole d’acqua oltre che i residui ionici o polari Gln69, Gln94, Arg96, His148, Thr203, Ser205 e Glu22216. Solo se il cromoforo è posizionato all’interno della proteina si ha un’alta resa quantica di fluorescenza. Infatti, la proteina denaturata, il cromopeptide isolato18 o analoghi sintetici del cromoforo hanno una fluorescenza modesta in soluzione, associata a rese quantiche intorno a 10-3. La struttura a cilindro è necessaria anche per schermare il cromoforo da agenti esterni in grado di deprimere la resa di fluorescenza (quenchers), tra i quali va annoverato l’ossigeno disciolto in acqua.