I cromofori delle GFP
Negli ultimi anni sono stati sintetizzati molti composti organici simili al cromoforo della GFP.
In tutti i casi, è stata mantenuta la struttura di base costituita da un anello imidazolinonico coniugato con un anello di tipo aromatico (fenilico) o eteroaromatico. I sostituenti di entrambi gli anelli sono stati variati al fine di studiare l’effetto di gruppi con caratteristiche elettroniche diverse (elettron attrattori, elettron donatori, elettron neutri) sulle proprietà ottiche del corrispondente cromoforo. I composti di sintesi più simili ai principali cromofori della classe delle proteine fluorescenti (GFP, Y66F GFP, BFP, CFP, dsRED, asFP595) presentano tutti deviazioni simili nelle caratteristiche ottiche rispetto alle proteine di riferimento. In particolare, gli spettri di assorbimento mostrano bande principali spostate verso lunghezze d’onda più basse (30-50 nm). Inoltre la resa quantica di
fluorescenza è 3-4 ordini di grandezza minore, e gli spettri di emissione mostrano un leggero blue-shift. La forma degli spettri di assorbimento ed emissione di questi composti sono, d’altro canto, molto simili a quelli delle rispettive proteine in forma denaturata.
L’origine del blue-shift degli spettri dei cromofori isolati dalla proteina non è molto chiara. L’effetto dei residui spazialmente prossimi al cromoforo sulle sue proprietà ottiche è peraltro ben noto anche all’interno delle varianti GFP. Per esempio, la YFP, caratterizzata da una sostituzione T203Y che induce la formazione di un p-stack tra il cromoforo e la Tyr203, mostra uno shift di circa 45-50 nm nell’assorbimento della forma ionizzata del cromoforo, e di circa 25 nm in quello della forma neutra.
Al contrario, l’origine della bassa resa quantica (~ 10-4) degli analoghi cromofori è stata analizzata in dettaglio con tecniche di fluorescenza sia continue sia risolte nel tempo42, 43, modificando la temperatura ed il solvente, e realizzando derivati con strutture push-pull a resa quantica elevata41. Apparentemente, il cromoforo al di fuori della struttura proteica possiede svariati canali di disattivazione non radiativa dello stato eccitato. Tra questi, il più rilevante consiste nella torsione intramolecolare (twist o hula-twist) attorno ai due angoli diedri b (N2-CA2-CB2-CG2) e g (CA2-CB2-CG2-CD1) della molecola nello stato eccitato, con conseguente rapida conversione interna in seguito all’attraversamento di una intersezione conica delle superfici di energia potenziale relative a S1 e S041. La riduzione della mobilità attorno al doppio legame CB2-CA2 attraverso un aumento della viscosità del solvente o un abbassamento della temperatura porta a un sensibile aumento della resa quantica di fluorescenza. Quando alla struttura base vengono aggiunti certi sostituenti (tipicamente un gruppo elettron attrattore in R1, e fenilico in R2,) l’equilibrio tra il canale non radiativo e radiativo viene modificato in favore di quest’ultimo, portando a composti moderatamente fluorescenti. Significativamente, solventi protici portano ad una diminuzione della resa quantica di fluorescenza, presumibilmente attraverso un processo di quenching dello stato eccitato che prevede la formazione di legami ad idrogeno con le molecole del solvente41.
Mediante tecniche, quali ad esempio la spettroscopia infrarossa ultraveloce in luce polarizzata, è stato possibile determinare che l’angolo b assume nello stato eccitato un valore tra 120° e 150°, ben lontano dal valore 0° prevedibile per una molecola completamente planare. A tale angolo dovrebbe corrispondere l’energia di attivazione richiesta per raggiungere l’intersezione conica attraverso la quale si ha il rilassamento non radiativo allo stato fondamentale. Misure semiquantitative indicano in c.a. 2 Kcal/mol l’energia di attivazione per l’analogo del cromoforo della GFP.
La torsione intramolecolare attorno agli angoli diedri b e g nello stato eccitato, secondo un meccanismo hula-twist è alla base del modello di isomerizzazione cis-trans proposto per spiegare il
fotocromismo di mutanti YFP. Pertanto, seguendo le implicazioni di questo modello, si dovrebbe osservare una significativa resa quantica di fotoconversione tra la forma cis e la forma trans nei cromofori di sintesi, per i quali il canale di disattivazione “torsionale” è molto efficiente. Nonostante questo, in letteratura è riportato solo uno studio secondo cui il fotoirraggiamento dell’analogo cromoforo di GFP porta ad una efficiente isomerizzazione cis-trans19. Tuttavia, in questo studio non sono investigati aspetti essenziali per la comprensione del processo, tra le quali spiccano le caratteristiche ottiche delle specie cis e trans, l’effetto di vari sostituenti molecolari e del solvente.